Julia Stiles wurde als das älteste von drei Kindern von John O'Hara, einem Lehrer und Geschäftsmann, und Judith Stiles, einer Töpferin, geboren. Ihre Familie ist Irisch-Englisch-Italienischer Abstammung. Sie besuchte eine Quäkerschule in Manhattan und studierte Englisch an der Columbia Universität in New York. Im Mai 2005 schloss sie ihr Studium, das sie mehrfach wegen verschiedener Filmprojekte unterbrach, nach fünf Jahren ab.
Stiles unterstützte als Demokratin John Kerrys Kandidatur zum Präsidenten der USA. Außerdem engagierte sie sich für eine Organisation, die Häuser auf Puerto Rico baut, und für Amnesty International, um auf die harten Bestrafungen von jugendlichen Immigranten aufmerksam zu machen.
Außerdem übernahm sie die Rolle einer CIA-Agentin in Die Bourne Identität mit Matt Damon sowie in Gelegenheit macht Liebe und Carolina von 2003. Ihre nächste Hauptrolle hatte Julia Stiles als Studentin in Mona Lisas Lächeln neben Julia Roberts, die als Kunstprofessorin ihre Studentin davon überzeugen will, dass sie lieber Rechtsanwältin statt Ehefrau und Mutter werden soll.